產品簡介

本款試劑盒是活性氧檢測試劑盒(CAT:#FS1176S)的升級產品。活性氧檢測試劑盒(CAT:#FS1176S)是一種利用熒光探針DCFH-DA(即H2DCFDA)進行活性氧檢測的試劑盒，而CM-H2DCFDA是H2DCFDA的氯甲基衍生物(Chloromethyl derivative)，也稱CM-DCFH-DA(CAT:#FS1399)，其在活細胞中比H2DCFDA具有更好的滯留率，因此熒光信號更強，且更適合細胞內活性氧的相對較長時間的研究。CM-H2DCFDA(CAT:#FS1399)本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成CM-H2DCF (也可稱為CM-DCFH)。而CM-H2DCF不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內[1-2]。CM-H2DCF(CAT:#FS1399)的氯甲基可與細胞內谷胱甘肽或其它巰基發生反應從而具有更好的細胞內滯留性，后續細胞內的活性氧可以氧化無熒光的CM-H2DCF生成有熒光的CM-DCF [3-6]，檢測CM-DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。

本試劑盒包含活性氧陽性對照Rosup，利于活性氧的檢測。Rosup是一種混合物，濃度為50mg/ml。因檢測對象和反應體系的不同，6孔板每孔檢測體系的體積為1ml時，分別可以檢測20次和100次；96孔板每孔檢測體系為100μl時，分別可以檢測200次和1000次。如果用于流式細胞儀，每個樣品檢測體系體積為0.5ml時，分別可以檢測40次和200次。

產品組成：

 組分編號        組分名稱                                               規格               儲存方法

 FS1399S-A 活性氧探針DCFH-DA（10mM）               20ul/100ul    -20℃避光保存

 FS11399S-B 活性氧陽性對照（Rosup, 50mg/ml）     20ul/100ul     -20℃保存

保存與運輸方法：-20ºC保存，有效期一年。運輸：冰袋運輸。

使用方法

1. 裝載探針

【注意】：對于刺激時間較短（通常2h以內）的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照Rosup和/或待研究藥物刺激細胞；對于刺激時間較長（通常6h以上）的細胞，先用活性氧陽性對照Rosup或待研究藥物刺激細胞，后裝載探針。

1.1 原位裝載探針（僅適用于貼壁細胞）

1）檢測前一天進行細胞鋪板，確保活性氧檢測當天細胞匯合率達到50~70%。

2）吸出細胞培養液，加入適量體積以及濃度的待研究藥物，于37ºC細胞培養箱內孵育，具體誘導時間根據細胞類型和藥物自身特性決定。

【可選】陽性對照Rosup：先用無血清培養液按照1:1000比例稀釋陽性對照，通常37℃培養箱內刺激20~30min可以觀察到顯著的活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異【刺激時間可參考文獻或實驗經驗來調整】。如果刺激后30min內未觀察到活性氧水平升高，可以適當提高Rosup的工作濃度；反之，如果活性氧升高過快，則適當降低Rosup的工作濃度。

3）按照1:1000用無血清培養液稀釋CM-H2DCFDA（10mM），使其終濃度為10μM.。吸出細胞培養液，加入適當體積CM-H2DCFDA工作液。【注意】：加入體積以能充分蓋住細胞為宜。對于6孔板，每個孔加入CM-DCFH-DA工作液不少于1ml。對于96孔板，每個孔加入CM-DCFH-DA工作液不少于0.1ml。

4）37ºC細胞培養箱內孵育20min。

5）用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的CM-DCFH-DA。

1.2 收集細胞后裝載探針

1）按照常規方法，清洗并收集足量的細胞。【注意】：保證細胞的狀態健康。

2）用適量體積以及濃度的待研究藥物重新懸浮細胞，于37ºC細胞培養箱內孵育，具體誘導時間根據細胞類型和藥物自身特性決定。【可選】陽性對照Rosup：先用無血清培養液按照1:1000比例稀釋陽性對照，通常37℃培養箱內刺激20~30min可以觀察到顯著的活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異【刺激時間可參考文獻或實驗經驗來調整】。如果刺激后30min內未觀察到活性氧水平升高，可以適當提高Rosup的工作濃度；反之，如果活性氧升高過快，則適當降低Rosup的工作濃度。

3）探針裝載前，按照1:1000用無血清培養液稀釋CM-DCFH-DA（10mM），使其終濃度為10μM.。

4）離心，吸出細胞內刺激藥物，之后用適量CM-DCFH-DA工作液重懸細胞，使得細胞密度為1×106~2×107/ml。【注意】：細胞密度需根據后續檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來調整。例如，對于流式分析，單管檢測內細胞數目控制在104~ 106之間。

5）37ºC細胞培養箱內孵育20min。每隔3~5min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。

6）用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的CM-DCFH-DA。

2. 檢測

2.1 原位裝載法

可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

2.2 收集細胞后裝載法

可用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

3. 參數設置

使用488nm激發波長，525nm發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可用FITC的參數設置檢測DCF。

4. 其他說明

1）對于某些細胞，若發現沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2000～1:5000稀釋CM-DCFH-DA，使CM-DCFH-DA的工作濃度為2～5μM。探針裝載時間也可依情況在15～60min內適當進行調整。

2）Rosup僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入Rosup陽性對照。

注意事項

1）探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針，否則會導致背景較高。

2）探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。

3）盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。