產(chǎn)品簡介

CM-H₂DCFDA，英文全名：5-(and 6-)chloromethyl-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester，中文全名：5-(and 6-)氯甲基-2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸乙酰酯，是一種通用的氧化應激指示劑，是H₂DCFDA（DCFH-DA，FS1176）的氯甲基衍生物，在活細胞中表現(xiàn)出更好的滯留率。CM-H₂DCFDA具細胞膜滲透性，主動擴散進入胞內(nèi)，其乙酸酯基團被細胞內(nèi)酯酶切割，其硫醇反應性的氯甲基基團與細胞內(nèi)谷胱甘肽和其他硫醇發(fā)生反應。后續(xù)氧化產(chǎn)生熒光加合物被捕獲在細胞內(nèi)，從而有助于長期研究。通過流式細胞儀、熒光計、熒光酶標板或熒光顯微鏡（配有適用于熒光素的激發(fā)光源和濾光片）對熒光信號進行監(jiān)測。

本品以粉末形式提供，可直接溶于無水DMSO配制成1-10mM儲存液，常用工作濃度1-10μM，需根據(jù)自身的實驗體系或參考文獻進行優(yōu)化。

產(chǎn)品特性

同義名：5-(and 6-)chloromethyl-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester; 5-(and 6-)氯甲基-2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸乙酰酯；

分子式：C₂₇H₁₉Cl₃O₈

分子量：577.8

純度：≥90%

外觀：粉末

激發(fā)/發(fā)射波長：~492–495/517–527 nm

溶解性：溶于DMSO、DMF、無水乙醇

運輸與保存方法:冰袋運輸。-20℃避光干燥保存， 1年有效。

使用方法（僅作參考）

以下步驟是來源于大量文獻總結(jié)的簡易操作流程，僅作參考。用戶需根據(jù)特定的應用和敏感性來做調(diào)整。

1. 儲存液制備

1.1）將低溫保存的凍干粉取出回至室溫，低速離心使粉末落到瓶底。之后加入適量無水DMSO或其他有機溶劑配制成1-10mM儲存液。未用完的DMSO儲存液需分裝并避光凍存在≤-20℃，避免反復凍融。

1.2）于正式實驗前，用生理鹽緩沖液（比如：PBS，HBSS，HEPES）稀釋到工作濃度1-10μM。需根據(jù)具體應用來調(diào)整合適的工作濃度。

1.3）吸走培養(yǎng)液，加入步驟2）配制的染色工作液到細胞內(nèi)，室溫或30℃孵育5~60min。

1.4）吸走染色工作液，用預熱的生理緩沖液或細胞培養(yǎng)液清洗一遍。重新加入預熱的生理緩沖液或細胞培養(yǎng)液，在適宜溫度內(nèi)孵育。對于二乙酸酯衍生物，需要短暫復原時間讓細胞內(nèi)酯酶將其水解，從而讓染料對氧化應激產(chǎn)生反應。最佳的復原時間范圍很廣，由于某些細胞類型通常顯示極其低水平的酯酶活性。

1.5）將細胞暴露于實驗刺激物之前，先測定加載細胞的背景熒光強度。

2.根據(jù)以下情況評估陰性對照（Negative control）

2.1）綠色發(fā)射光譜內(nèi)檢查未染色細胞的自熒光情況。

2.2）對于流式分析，查明染料加載和處理后細胞的前向角散射和側(cè)向角散射是不變。細胞尺寸的變化可能與起泡或萎縮有關(guān)，由于處理或有毒反應引起的。

2.3 ）對包含和不包含刺激物的染料和緩沖液/培養(yǎng)基的無細胞混合物進行熒光檢測。在不含細胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，隨著時間熒光的逐漸增加可能與瞬間水解、空氣氧化、和/或光誘導氧化有關(guān)。

2.4 ）檢查培養(yǎng)在生長培養(yǎng)液或簡單緩沖液內(nèi)的未處理加載細胞（對照）的熒光。在健康細胞內(nèi)，細胞內(nèi)酶和/或天然抗氧化劑會清除這些氧自由基。經(jīng)過染料加載復原時間后，健康細胞應該表現(xiàn)出低水平的熒光信號，且在整個實驗期間相對穩(wěn)定。然而，逐漸增加（由于自氧化）或降低（由于細胞內(nèi)染料喪失或光淬滅）也有可能觀察到。在不含任何刺激物或誘導劑的體系內(nèi)，健康和未處理細胞突然發(fā)現(xiàn)強熒光，表明細胞發(fā)生死亡或一些其他的氧化事件。

3.建立陽性對照（Positive control）可能用以下方法刺激氧化活性：

3.1) 腫瘤促進劑（PMA，工作濃度100pM~10μM）（#FS1283）

3.2) 細菌趨化肽（fMLP，工作濃度1~10μM）（# FS1419）

3.3) H2O2或TBHP（終濃度~100μM）（根據(jù)細胞本身對其的靈敏度和反應性來提高或降低濃度）

確保刺激藥物或化合物不會引起染料熒光淬滅。檢查化合物的吸收光譜，確定化合物的吸收峰不會與氧化后染料的最大激發(fā)或發(fā)射光譜發(fā)生重疊。

注意事項

1）有機溶劑如DMSO儲存液需分裝成單次用量后，-20ºC避光保存，避免反復凍融。

2）熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

相關(guān)產(chǎn)品