產品簡介

DMAO，即N, N-dimethylaniline N-oxide，是一種核酸綠色熒光染料，對于革蘭氏陽性和陰性細菌均適用，且既能染色活細菌，也能染色死細菌。該染料具有膜通透性，能透過細胞膜，優(yōu)先結合雙鏈DNA。DMAO非常穩(wěn)定，在室溫下進行常規(guī)操作和保存不易降解。PI是一種非滲透性熒光染料，不能穿過具有生物活性的細胞質膜，因此對于具有完整細胞膜的細菌不能染色。而對于壞死細菌，其細胞膜的完整性喪失，PI可進入細胞核并與雙鏈DNA結合，并嵌入細菌的DNA雙螺旋形成PI-DNA復合物從而產生紅色熒光，這種結合很少或幾乎沒有序列偏好，每4-5個堿基對插入一分子PI染料。將DMAO與PI聯(lián)合使用檢測細菌的死活，具有完整細胞膜的活細菌呈現(xiàn)綠色熒光，細胞膜受損的死細菌同時呈現(xiàn)綠色與紅色熒光。

DMAO-DNA復合物的最大激發(fā)光波長為503nm，最大發(fā)射光波長為530nm；PI-DNA復合物的最大激發(fā)光波長為535nm，最大發(fā)射光波長為617nm。DMAO-DNA和PI-DNA的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖1，可分別使用FITC和Cy3通道觀察。

本品中文名稱細菌死活染色試劑盒(DMAO/PI)，英文名稱LIVE/DEAD Bacterial Staining Kit with DMAO & PI，或LIVE/DEAD Bacterial Viability Kit with DMAO and PI，也稱細菌活力檢測試劑盒(Bacterial Viability Assay Kit)或細菌毒性檢測試劑盒(Bacterial Cytotoxicity Assay Kit)，是一種高效、便捷、靈敏的基于DNA綠色熒光染料DMAO和紅色熒光染料碘化丙啶(Propidium iodide, PI)的雙熒光染色法檢測細菌死活的試劑盒。本試劑盒檢測時，活細菌呈現(xiàn)綠色熒光，死細菌呈現(xiàn)綠色和紅色兩種熒光。本試劑盒可使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光酶標儀、流式細胞儀等熒光檢測系統(tǒng)進行檢測。

本試劑盒提供的DMAO與PI均為1000×的儲存液，溶液經過優(yōu)化，對大多數(shù)細菌都適用，但為了獲得更滿意的結果，對于不同類型的細菌請自行進行一定的濃度摸索，DMAO和PI的使用終濃度一般為0.5-2×，最優(yōu)先的推薦終濃度為1×。同時，本試劑盒提供檢測緩沖液，該緩沖液可用于細菌死活染色工作液的配制。

                                                                           圖1.DMAO-DNA和PI-DNA的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

產品組成

保存與運輸方法:-20℃避光保存，有效期一年。 冰袋運輸。

使用方法(以下步驟僅用作示例以指導科研人員開展自身細菌樣本的染色。)

一、培養(yǎng)條件和細菌懸液的制備

【注意】：用本試劑盒進行細菌染色，務必要小心去除培養(yǎng)基殘留，因為，核酸和其它培養(yǎng)基成分可能以不可預料的方式與DMAO和PI結合，導致染色結果發(fā)生不可接受的變動。簡單的一次清洗步驟通常足以去除培養(yǎng)基內含的培養(yǎng)基成分干擾物殘留。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液，因此可能降低染色效率。

1.1 用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)大腸桿菌或金黃色葡萄球菌（30ml）使其生長至對數(shù)生長后期。

1.2 于10000×g離心10-15min，濃縮25ml細菌培養(yǎng)物。

1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl或適當緩沖液來重懸沉淀。

1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCl或適當緩沖液的30-40ml離心管（設置為活細菌組），用含20ml 70%異丙醇（也可以用其他方法比如高熱處理殺死細菌）的30-40ml離心管（設置為死細菌組）。

1.5 兩管樣品（分別為活細菌組和死細菌組）于室溫孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次。

1.6 兩管樣品（分別為活細菌組和死細菌組）于10000×g離心10-15min。

1.7 用20ml 0.85% NaCl或適當緩沖液重懸沉淀，并且按照步驟1.6再離心一次。

1.8 分別用10ml 0.85% NaCl或適當緩沖液重懸兩管樣品。

1.9 分別取3ml菌液測定670nm的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路徑）。

1.10 對于大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的建議染色濃度，根據(jù)你的儀器類型（熒光顯微鏡、熒光光度經、熒光酶標儀）或流式細胞儀來參考相應部分的染色條件。

二、熒光顯微鏡操作步驟

2.1活菌和死菌的熒光可能用標準的熒光素長通濾片設置來同時觀察。替代方案的話，活菌（綠色熒光）和死菌（紅色熒光）可分別用雙通道：熒光素FITC和Texas Red帶通濾光片設置。用于本試劑盒檢測的建議熒光顯微鏡濾片設置見表1。

表1 適用于本試劑盒檢測用的常見濾光片特征

油鏡100×計數(shù)＞5個視野，計算存活率：存活率（%）=綠色熒光細胞數(shù)/(綠色+紅色光細胞數(shù))×100

三、流式細胞儀操作步驟

儀器的檢測配置可能要因實際情況來調整，但此處列出的檢測技術和設置參數(shù)適用于市場上絕大多數(shù)流式細胞儀。

FL1通道： (530/30nm) DMAO (檢測活菌) 

FL3通道： (＞670nm) PI (檢測死菌) 

閾值設定：排除粒徑＜0.2um碎片（避免假陽性）

結果判斷與數(shù)據(jù)驗證分析

注意事項

1) 由于試劑盒內DMAO和PI的組分量少，室溫回溫充分融化后，務必低速離心沉至管底后再開蓋。

2) 兩款探針溶液本身就是溶于DMSO中，所以后續(xù)無需再單獨添加，第一次使用可將DMAO和PI根據(jù)單次用量分裝保存，密封后置于≤-20℃避光保存。

3) 組分C檢測緩沖液經過過濾除菌處理，在使用時須注意避免微生物污染，否則很可能嚴重影響染色效果。如果檢測緩沖液發(fā)生渾濁等明顯的微生物污染，就不能繼續(xù)使用。

4) DMAO 和PI結合核酸，PI是潛在的誘變劑，目前沒有數(shù)據(jù)闡明DMAO的誘變性或毒性，兩種試劑使用都需做恰當防護。DMSO能促進有機分子進入組織。強烈建議處理DMSO儲存液時戴雙層手套。對于核酸染料，含此類染料的試劑經活性炭吸附后再進行廢液處理。活性炭之后經焚燒來破壞染料。

5) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

常見問題及解決方案

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