產品簡介

酸性磷酸酶(Acid Phosphatase)，也稱酸性磷酸酯酶，在酸性條件下可以催化磷酸酯鍵的水解。酸性磷酸酶是一個蛋白家族，哺乳動物中其分子量從18kD到100kD不等。酸性磷酸酶主要分為兩類，一類為抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)，一類為抗氟離子酸性磷酸酶。

抗酒石酸酸性磷酸酶是一種糖基化的含金屬蛋白酶，在破骨細胞(osteoclast)和破軟骨細胞(chondroclast)中高表達。在活化的巨噬細胞和神經元中也有表達?？咕剖崴嵝粤姿崦冈诩毎盘栟D導、細胞增殖和分化等方面起重要作用，也和活性氧產生和鐵離子轉運等有關?？咕剖崴嵝粤姿崦缚梢员黄乒羌毎尫诺窖褐校瑤缀醣徽J為是是機體破骨活性的唯一血液指標。

Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)是一種常用的磷酸酶顯色底物，在酸性條件下，可在酸性磷酸酶作用下生成para-nitrophenol。para-nitrophenol (p-nitrophenol)在堿性條件下，呈黃色產物，可以在400-415nm檢測吸光度。產物黃色越深， 說明酸性磷酸酶檢活性越高，反之則酶活性越低。據此通過比色分析就可以計算出酸性磷酸酶活性水平。在適量的酒石酸存在的情況下進行酸性磷酸酶的活性檢測，檢測得到的酸性磷酸酶活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶活性。

本試劑盒抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒(Tartrate Resistant Acid Phosphatase Assay Kit)是一種用于快速、便捷地檢測細胞或組織樣品的裂解或勻漿產物的上清液、血漿、血清、尿液等樣品中內源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性的試劑盒。包括標準品和空白對照，本試劑盒共可進行100-120個樣品的檢測。

產品組成

存儲條件：-20℃保存，一年有效。 

操作步驟：
1. 試劑準備：

1-1將試劑盒所有試劑取出，恢復至室溫使用。
1-2. 顯色底物溶液配置：取一管試劑B顯色底物ACP Assay Buffer，溶解于2.5ml的檢測緩沖液中，充分溶解和混勻，冰上放置。新鮮配制的顯色底物溶液需在6小時內使用。
1-3. 標準品工作液配置：取10μl p-nitrophenol溶液(10mM)，用檢測緩沖液稀釋至0.2ml，最終濃度為0.5mM。

按下表繼續稀釋：

2. 樣品準備：
2-1. 細胞或組織裂解液的準備：采用適當細胞或組織裂解液裂解細胞或組織，建議使用 Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)（推薦貨號CAT:FS1008）裂解相關樣品。如果有必要需進行適當勻漿，隨后離心取上清，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的檢測。注意：裂解液中不能含有磷酸酶抑制劑。一般細胞數量在10⁶以上，組織應在100mg以上，3000~4000g 離心取上清樣品可以-80℃凍存，但需避免反復凍融。
2-2. 血漿、血清和尿液的準備：血漿和血清按照常規方法制備后可以直接用于本試劑盒的測定，但為了消除樣品本身顏色的干擾，需設置加了血漿或血清但不加底物的對照。尿液通常也可以直接用于測定。上述樣品可以-80℃凍存，但需避免反復凍融。
2-3. 樣品的稀釋：如果樣品中含有較高活性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶，可以使用原有的裂解液或PBS等進行稀釋，也可以采用試劑。
盒中的檢測緩沖液進行稀釋。如果使用試劑盒中提供的檢測緩沖液進行稀釋，需注意保留足夠的檢測緩沖液用于試劑盒的檢測過程。

2-4.植物樣品： 取適量的植物組織加入少量 PBS 或生理鹽水， 充分搗碎或研磨，靜置 30min，用紗布或濾紙過濾，4000g 離心 20min，留取上清液并測量體積，-20℃凍存， 用于 TRAP 的檢測。

2-5.高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的 TRAP，可以使用 ACP Assay Buffer、PBS 或生理鹽水稀釋后再行檢測。
3. 參考下表TRAP加樣：按按照下表設置空白孔、標準孔、空白孔，溶液應按照順序依次加入，并 注意避免產生氣泡；如果樣品中的 TRAP 活性過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再 進行測定，樣品的檢測最好能設置平行孔。

4. 用槍頭輕輕吹打混勻，也可借助搖床進行混勻。
5. 37℃孵育5-10分鐘。(說明：待測樣品中酒石酸酸性磷酸酶活性較低時，可適當延長孵育時間至30分鐘)
6. 每孔加入160μl反應終止液終止反應。此時，標準品或有酒石酸酸性磷酸酶活性的孔會呈現不同深淺的黃色。
7. 在405nm測定吸光度。如果不能測定405nm，也可以在400-415nm范圍內檢測吸光度。如果不能立即測定，可以在數小時內完成測定，所顯現的黃色在數小時內穩定。
8. 酸性磷酸酶活性單位的定義：在pH4.8，37℃條件下，每分鐘水解para-nitrophenyl phosphate顯色底物產生1微摩爾p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位。
9. 根據酶活性定義，計算出樣品中的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。

計算： 系列標準品(1~6 號)濃度(即 p-NP 含量)0.002、0.004、0.008、0.012、0.016、0.02 μM 為橫坐標，以對應的標準孔吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，根據測定孔的吸光度在標 準曲線上查得待測樣品 p-NP 的生成量。

酸性磷酸酶活性單位的定義：在 pH 值 4.8 37℃條件下，每分鐘水解 pNPP 顯色底物 產生1 μM p-NP 所需的酸性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位，根據酶活性定義，計算出 樣品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。

TRAP 酶活性(μM/min)=待測樣品 p-NP 生成量/孵育時間

注意事項：

1. 如果希望進行酶活性的絕對定量，進行酶反應時必須注意精確計時。此時推薦采用孵育30分鐘等較長的時間，以減小操作過程中的時間誤差。同時如果樣品中酶活性較高，則可以預先適當稀釋樣品。

2. p-nitrophenol溶液對人體有害，反應終止液有腐蝕性，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內。

3. 樣品溶液中須避免出現各種酸性磷酸酶抑制劑。

4. 一管顯色底物配制后需當日使用完畢，因此請注意適當多準備一些樣品一起檢測，以避免試劑盒浪費。

5. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。