產品簡介

JC-10是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm 的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。JC-10是一種新型的用來監測線粒體膜電位變化的熒光探針，是JC-1的優越替代物。與JC-1相比，具有以下幾個重要優勢：1）溶解性得以改良——在水溶液中形成沉淀可能性明顯降低；2）使用更方便——簡化步驟將手動操作時間最小化；3）熒光信號更高——改良的信號與背景熒光的信噪比；4）結果更穩定——優化探針以保證更連續性和穩定性結果。

JC-10是一種替換JC-1，用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針。JC-10以電勢依賴性的方式積聚在線粒體內，可以用來檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。正常線粒體內，JC-10聚集在線粒體基質中形成聚合物，聚合物發出強烈的紅色熒光（Ex=540 nm, Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-10只能以單體的形式存在于胞漿中，產生綠色熒光（Ex=490 nm, Em=525 nm）。JC-10不僅可用于定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測，因線粒體的去極化程度可以通過紅/綠熒光強度的比例來衡量。

本試劑盒提供CCCP用作線粒體膜電位喪失的陽性對照。對于六孔板樣品，本試劑盒可檢測100個樣品。

產品組成

保存及運輸：-20℃避光干燥保存，至少1年有效。運輸：冰袋運輸

使用方法 

1. JC-10 染色工作液制備

對于六孔板，本試劑盒可檢測100個樣品。每孔所需JC-10染色工作液的量為1ml，其他培養器皿的 JC-10染色工作液的用量以此類推；對于細胞懸液每 50～100萬細胞需 0.5mL JC-10染色工作液。 取適量 JC-10（200×），按照每50μL JC-10（200×）加入 8mL 超純水的比例稀釋 JC-10。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-10。然后再加入 2mL JC-10 染色緩沖液（5×），混勻后即為 JC-10 染色工作液。

【注意】：必須先把 JC-10（200×）用超純水（試劑盒提供）充分溶解混勻后，才可加入 JC-10 染色緩沖液（5×）。不可先配制 JC-10 染色緩沖液（1×）再加入 JC-10（200×），這樣 JC-10 會很難充分溶解，會嚴重影響后續的檢測。

2. 陽性對照的設置

CCCP（10mM）推薦按 1∶1000 的比例加入到細胞培養液中，稀釋至 10μM，處理細胞 20min。隨后按照下述方法裝載 JC-10，進行線粒體膜電位的檢測。 對于大多數細胞，通常 10μM CCCP 處理 20 min 后線粒體的膜電位會完全喪失，JC-1 染色后觀察應呈綠色熒光；而正常的細胞經 JC-10 染色后應顯示紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能

有所不同，需自行參考相關文獻資料決定。

3. 對于懸浮細胞

1）取10～60 萬細胞，重懸于 0.5mL 細胞培養液中，細胞培養液中可以含血清和酚紅。

2）加入0.5mL JC-10染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養箱中 37℃孵育 20min。

3）孵育期間，按照每 1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

4）37℃孵育結束后，600×g4℃離心 3～4min 沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。

5）用 JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次：加入 1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g4℃離心 3～4min沉淀細胞，棄上清。再加入 1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g4℃離心 3～4min 沉淀細胞，棄上清。

6）再用適量 JC-1 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光 光度計檢測或流式細胞儀分析。

4. 對于貼壁細胞

【注意】：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的方法進行檢測。

1）對于六孔板的一個孔，吸除培養液，根據具體實驗如有必要可用 PBS 或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入 1mL 細胞培養液。細胞培養液中可以含有血清和酚紅。

2）加入 1mL JC-10 染色工作液，充分混勻。細胞培養箱中 37℃孵育 20min。

3）孵育期間，按照每 1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

4）37℃孵育結束后，吸除上清，用 JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次。

5）加入 2mL 細胞培養液，培養液中可以含有血清和酚紅。

6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5. 對于純化的線粒體

1）將配制好的 JC-10 染色工作液再用 JC-10 染色緩沖液（1×）稀釋 5 倍。

2）0.9mL 5 倍稀釋的 JC-10 染色工作液中加入 0.1mL 總蛋白量為 10～100μg 純化的線粒體。

3）用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描（time scan），激發波長為485nm，發射波長為 590nm。如果使用熒光酶標儀，激發波長不能設置為 485nm 時，可在475～520nm范圍內設置激發波長。另外，也可以參考下面步驟6中的波長設置進行熒光檢測。

4）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6。

6. 熒光觀測和結果分析

檢測JC-10 單體時可以把激發光設置為490nm，發射光設置為530nm；檢測 JC-10 聚合物時，可以把激發光設置為540nm，發射光設置為595nm。

【注1】：此處測定熒光時不必把激發光和發射光設置在最大激發波長和最大發射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測 JC-1 聚合物時可使用常來檢測碘化丙啶或者 Cy3 用的標準帶通濾波器。檢測 JC-1 單體可使用常來檢測 FITC 或 GFP 的標準帶通濾波器。出現綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態也比較正常。

注意事項

1）JC-10（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2）裝載完 JC-10后用 JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌時，使 JC-10 染色緩沖液（1×）保持 4℃左右，此時洗滌效果較好。

3）JC-10 探針裝載完并洗滌后盡量在 30min 內完成后續檢測。在檢測前需冰浴保存。

4）請勿把JC-10染色緩沖液（5×）全部配制成JC-10染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-10 染色緩沖液（5×）。

5）如果發現JC-10 染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，可在 37℃加熱促進溶解。

6）CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。

7）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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