產(chǎn)品簡介

JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一種以JC-1為熒光探針，快速且靈敏的檢測細胞、組織或純化線粒體膜電位變化的試劑盒。因線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。因此本試劑盒可用于早期的細胞凋亡檢測。

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm 位的理想熒光探針。JC-1染料以電勢依賴性的方式積聚在線粒體內(nèi)，可以用來檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強烈的紅色熒光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-1 只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。JC-1 不僅可用于定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測，因線粒體的去極化程度可以通過紅/綠熒光強度的比例來衡量。

產(chǎn)品組成

保存及運輸：-20℃避光干燥保存，至少1年有效。運輸：冰袋運輸

使用方法 

1. JC-1 染色工作液制備

對于六孔板，本試劑盒可檢測100個樣品。每孔所需JC-1染色工作液的量為1ml，其他培養(yǎng)器皿的 JC-1染色工作液的用量以此類推；對于細胞懸液每 50～100萬細胞需 0.5mL JC-1 染色工作液。 取適量 JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200×）加入 8mL 超純水的比例稀釋 JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻 JC-1。然后再加入 2mL JC-1 染色緩沖液（5×），混勻后即為 JC-1 染色工作液。

【注意】：必須先把 JC-1（200×）用超純水（試劑盒提供）充分溶解混勻后，才可加入 JC-1 染色緩沖液（5×）。不可先配制 JC-1 染色緩沖液（1×）再加入 JC-1（200×），這樣 JC-1 會很難充分溶解，會嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測。

2. 陽性對照的設(shè)置

CCCP（10mM）推薦按 1∶1000 的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋至 10μM，處理細胞 20min。隨后按照下述方法裝載 JC-1，進行線粒體膜電位的檢測。 對于大多數(shù)細胞，通常 10μM CCCP 處理 20 min 后線粒體的膜電位會完全喪失，JC-1 染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細胞經(jīng) JC-1 染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能

有所不同，需自行參考相關(guān)文獻資料決定。

3. 對于懸浮細胞

1）取10～60 萬細胞，重懸于 0.5mL 細胞培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

2）加入0.5mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20min。

3）孵育期間，按照每 1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

4）37℃孵育結(jié)束后，600×g4℃離心 3～4min 沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。

5）用 JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次：加入 1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g4℃離心 3～4min沉淀細胞，棄上清。再加入 1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g4℃離心 3～4min 沉淀細胞，棄上清。

6）再用適量 JC-1 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光 光度計檢測或流式細胞儀分析。

4. 對于貼壁細胞

【注意】：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的方法進行檢測。

1）對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可用 PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細胞一次，加入 1mL 細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

2）加入 1mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20min。

3）孵育期間，按照每 1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

4）37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次。

5）加入 2mL 細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5. 對于純化的線粒體

1）將配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 染色緩沖液（1×）稀釋 5 倍。

2）0.9mL 5 倍稀釋的 JC-1 染色工作液中加入 0.1mL 總蛋白量為 10～100μg 純化的線粒體。

3）用熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描（time scan），激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為 590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為 485nm 時，可在475～520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟 6 中的波長設(shè)置進行熒光檢測。

4）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6。

6. 熒光觀測和結(jié)果分析

檢測 JC-1 單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm，發(fā)射光設(shè)置為 530nm；檢測 JC-1 聚合物時，可以把激發(fā)光設(shè)置為 525nm，發(fā)射光設(shè)置為 590nm。

【注1】：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測 JC-1 聚合物時可使用常來檢測碘化丙啶或者 Cy3 用的標(biāo)準(zhǔn)帶通濾波器。檢測 JC-1 單體可使用常來檢測 FITC 或 GFP 的標(biāo)準(zhǔn)帶通濾波器。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常。

注意事項

1）JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以 20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2）裝載完 JC-1 后用 JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌時，使 JC-1 染色緩沖液（1×）保持 4℃左右，此時洗滌效果較好。

3）JC-1 探針裝載完并洗滌后盡量在 30min 內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。

4）請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1 染色緩沖液（5×）。

5）如果發(fā)現(xiàn) JC-1 染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，可在 37℃加熱促進溶解。

6）CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。

7）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

相關(guān)產(chǎn)品

 部分引用文獻

(1) [IF=9.7]Contribution of ferroptosis and GPX4’s dual functions to osteoarthritis progression-EBioMedicine Published:January 27, 2022 DOI:https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.103847

此圖的原始數(shù)據(jù)出自文獻（1）中。

(2) [IF=11.4]VDR regulates mitochondrial function as a protective mechanism against renal tubular cell injury in diabetic rats.  -Redox Biology -Volume 70, April 2024, 103062.V

此圖的原始數(shù)據(jù)出自文獻（2）中。

(3)[IF=11.1]LONP1 targets HMGCS2 to protect mitochondrial function and attenuate chronic kidney disease-EMBO Mol Med(2023)15: e16581 https://doi.org/10.15252/emmm.202216581

                                             免疫熒光共定位分析mPTC(上，標(biāo)尺:20um)和人腎組織(下，標(biāo)尺:200um)中LONP1、HMGCS2和線粒體。

 此圖的原始數(shù)據(jù)出自文獻（3）中。